Способ получения пептидов

Владельцы патента RU 2544959:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения пептидов. Проводят автолиз дрожжей. Отделяют клеточные оболочки центрифугированием. Очищают автолизат на гелевом сульфокатионите в водородной форме, содержащем 12-16% дивинилбензола. Полученный водный раствор пептидов пропускают последовательно через гелевый анионит до получения раствора с рН 2,0-2,6, а затем через гелевый катионит с содержанием дивинилбензола 1-2% или макропористый катионит. Преимуществом заявленного способа является получение пептидов высокой степени очистки, которые обладают биологической активностью. 11 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения пептидов из дрожжевых автолизатов.

В современных технологических процессах дрожжи используют в качестве сырья для получения различных продуктов, биологически активных веществ, аминокислот, нуклеиновых компонентов, витаминов и т.д. К числу известных способов переработки дрожжевой биомассы относится автолиз, осуществляемый собственными гидролитическими ферментами дрожжей. В ходе автолиза происходит накопление в автолизате свободных аминокислот, низших (ди-, три-, тетра-) пептидов и пептидов с более высокой молекулярной массой.

Известны способы получения биологически активных пептидов-аналогов природных пептидных регуляторов, иммуномодуляторов, морфиноподобных пептидов, антимикробных пептидов и других методами химического синтеза или химической модификации природных пептидных регуляторов или активной части их структуры (патенты РФ №№2043769, 2047621, 2060998, 2067000, 2087480, 2107691, 2126014, 2141527, 2145233, 2145234, 2146262, 2316336, 2478105, 2494105, 2182155, 2111215). Недостатком известных способов является необходимость информации о точной структуре природного аналога, дорогостоящая и сложная процедура пептидного синтеза из исходных производных аминокислот, не позволяющая зачастую получить промышленные количества продукта.

Известны способы получения природных пептидов из органов и тканей сельскохозяйственных животных (патенты РФ №№2075944, 2104702, 2161501, 2043364). Недостатком этого способа является дефицит этого вида природного сырья.

Известен способ получения продукта, содержащего гипотензивные пептиды и его применения в качестве антигипертензивного, годного в пищу продукта (патент РФ №2276689, МПК С12Р 21.02; A23J 1/20, публикация 2006 г.). Способ включает стадии ферментации казеинсодержащего заквасочного материала молочно-кислой бактерией, нанофильтрации полученного пептидсодержащего ферментационного продукта и выделения продукта. Полученный продукт используют в качестве антигипертензивного агента, а также как годный в пищу продукт.

Недостатком известного способа является невысокая степень очистки пептидов.

Известен способ получения пептидов и аминокислот из белкового сырья (патент РФ №2333663, МПК A23J 3/04, публикация 2008 г.), по которому сырьем служит казеин молока, а гидролиз его осуществляют в присутствии эндогенных ферментов и далее подвергают разделительной обработке, включающей коагуляцию белковых остатков.

Известен также способ получения пептидов с высоким содержанием триптофана (патент РФ №2043364, МПК C07K 1/12; A61K 38/01, публикация 1995 г.), включающий суспендирование белка фибриногена в воде, последующий щелочной и ферментативный гидролиз белка, инактивирование фермента при 90-100°C в течение 15-20 мин, центрифугирование гидролизата, осаждение конечного продукта из надосадочной жидкости ацетоном и сушку осадка.

Недостатком указанных способов является использование дефицитного сырья и экзогенных ферментов.

Известны способы получения смеси аминокислот и низших пептидов путем автолиза дрожжей с последующей очисткой целевого продукта на ионитах (например, патент США №2272982, патент Великобритании №952713, авт. свидетельства СССР №№957835, 1369300, 1731806).

Известен также способ получения смеси аминокислот и пептидов путем фильтрации автолизата через слабоосновный анионит ИА-1р с последующей сорбцией из фильтрата аминокислот и низших пептидов на сульфокатионите КУ-2×8, упариванием элюата и сушкой готового продукта (авт. свидетельство СССР №602543).

Существенными недостатками известных способов является высокое содержание в целевом продукте аминокислот, составляющих 70-76% от общего количества продукта, что обусловливает ограничение сферы использования продукта в качестве средства пищевого и фармакологического назначения, а также в виде пептидного компонента при создании микробиологических питательных сред и парфюмерных композиций.

Известен способ получения низкомолекулярных пептидов, обладающих интерферонстимулирующей активностью (патент РФ №2409678, МПК С12Р 21/00; C07K 1/34, публикация 2011 г.), согласно которому в качестве сырья используют отход при производстве препарата лактоглобулина, который подвергают диализу на полисульфидных мембранных фильтрах с диаметром пор 1 кДа против дистиллированной воды до достижения концентрации общего белка в препарате 3 мг/мл с последующим концентрированием методом ионообменной хроматографии в геле и элюцией 0,5М раствором хлорида натрия. Исходным сырьем для получения низкомолекулярных пептидов служит отход производства лактоглобулина против условно патогенных бактерий и сальмонелл (патент РФ №2298409, публикация 2007 г.), в соответствии с которым иммунное молозиво коров подвергают сбраживанию пепсином, удаляют творожную массу. Из полученной иммунной сыворотки молозива коров методом ультрафильтрации удаляют денатурированные белки и жир, получая очищенную лактосыворотку. Полученную лактосыворотку разделяют на ультрафильтрационной установке на две фракции: высокомолекулярную фракцию (лактоглобулин) и содержащий низкомолекулярные (1-5 кДа) пептиды фильтрат в качестве отхода производства, который и используют для получения НМП.

Существенным недостатком указанного способа является дефицит сырья (молозиво коров), крайне низкое содержание целевого продукта в отходе, требующее предварительной концентрации на мембранных фильтрах.

Известен способ получения смеси аминокислот и низших пептидов, включающий автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием и очистку автолизата на ионитах, отличающийся тем, что в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола (патент РФ №2284356, МПК С12Р 13/06; A23J 1/18, публикация 2006 г. — ближайший аналог).

Недостатком указанного способа является то, что в отходе (проскоке с катионита) содержится ценный продукт — пептиды, который можно извлечь только с применением дополнительных операций выделения и очистки.

Целью настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа получения высокоочищенной смеси пептидов из практически неограниченного возобновляемого сырья — дрожжей.

Указанная цель достигается тем, что в качестве сырья используется отход при производстве смеси аминокислот и низших пептидов из дрожжей, содержащий пептиды.

Сущность предложенного способа заключается в следующем.

Способ получения пептидов включает автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием, очистку автолизата на ионитах и получение водного раствора пептидов (проскок), при этом в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола, при этом полученный водный раствор пептидов пропускают последовательно через гелевый анионит до получения раствора с pH 2,0-2,6, а затем через гелевый катионит с содержанием дивинилбензола 1-2% или макропористый катионит.

В ходе производственного процесса по выделению аминокислот и низших пептидов автолизат обрабатывают следующим образом: отделяют клеточные оболочки центрифугированием, полученный раствор подвергают ультрафильтрации через мембраны с номинальной отсекаемой молекулярной массой (НОММ) 5-15 кДа, ультрафильтрат подкисляют до pH 3,0 и пропускают через сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола. При этом аминокислоты и низшие пептиды сорбируются на катионите, а пептиды с более высокой молекулярной массой не сорбируются и концентрируются в отходе (проскоке). Это позволяет практически полностью отделить индивидуальные (свободные) аминокислоты от пептидов в одноактном процессе сорбции из автолизата, при этом целевой продукт — пептиды остаются в растворе.

Проскок представляет собой водный раствор целевого продукта (пептидов) с низким pH (1,0-1,2), перегруженный балластными органическими (пигментированными) и минеральными веществами. Сущность предложенного способа получения смеси пептидов заключается в выделении пептидов из проскока. Для этого проскок фильтруют через колонку с анионитом до получения раствора с pH 2,0-2,6 (предпочтительно 2,4), а затем пропускают через гелевый сульфокатионит в водородной форме с содержанием ДВБ 1-2% или через макропористый сульфокатионит. Десорбцию с катионита ведут 2,5-3,0% водным раствором аммиака, полученный элюат упаривают для отгонки аммиака и сушат на сублимационной сушилке.

Существенными преимуществами предлагаемого изобретения по сравнению с известными является то, что в ходе процесса достигается высокая степень очистки продукта от сопутствующих минеральных и органических веществ. Способ позволяет получать пептиды, не

содержащие аллергены и нуклеиновые компоненты, жиры, сахара и соли. Способ позволяет получать пептиды из практически неограниченного возобновляемого сырья — пекарских или пивных дрожжей. Получаемый по заявляемому способу продукт обладает выраженной биологической активностью.

Физико-химический анализ продукта показал, что содержание пептидов в сухом продукте составляет 88-92%, аминокислот 6-9%. Продукт состоит из смеси 22 индивидуальных пептидов с молекулярной массой от 0,8 до 2,5 кДа. В экспериментальном исследовании продукт показал выраженную противоишемическую активность, перспективен в плане профилактики и терапии ишемической болезни сердца.

35 л проскока, полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с сильно сшитым (12% ДВБ) сильноосновным анионитом Dowex 550А, объем анионита 3,5 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 1,0 л дистиллированной воды. Получают 36 л раствора с pH 2,2. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3%) аммиаком. Получают 3 л элюата (pH 10,2), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,43 кг продукта, содержащего 90% пептидов и 7% аминокислот.

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с сильноосновным высокоемким полиакриловым гелевым анионитом Purolite А830 в ОН — форме, объем анионита 2,0 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в H+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3 л элюата (pH 10,2), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,44 кг продукта, содержащего 89% пептидов и 7% аминокислот.

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН — форме, объем анионита 2,0 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3,2 л элюата (pH 10,4), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,3 кг продукта, содержащего 76% пептидов и 8% аминокислот.

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН — форме, объем анионита 2,0 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с гелевым слабо сшитым (1% ДВБ) катионитом Dowex W50×l в Н+ форме, объем катионита 13 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3,2 л элюата (pH 10,3), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,42 кг продукта, содержащего 91% пептидов и 5% аминокислот.

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом, объем анионита 2 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с гелевым сульфокатионитом Dowex W50×2, содержащим 2% сшивки (ДВБ) в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 2,7 л элюата (pH 10,1), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,4 кг продукта, содержащего 88% пептидов и 9% аминокислот.

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом, объем анионита 2 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с гелевым сульфокатионитом Dowex W50×4 (4% ДВБ) в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 2,7 л элюата (pH 10,1), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,22 кг продукта, содержащего 75% пептидов и 8% аминокислот.

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН — форме, объем анионита 2,2 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды и получают 35,5 л раствора с pH 2,7. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3 л элюата (pH 10,2), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,40 кг продукта, содержащего 87% пептидов и 9% аминокислот.

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН — форме, объем анионита 1,8 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды и получают 35,5 л раствора с pH 1,9. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3 л элюата (pH 10,2), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,39 кг продукта, содержащего 85% пептидов и 9% аминокислот.

35 л проскока с pH 1,2, полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в H+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, и поступают, как в примере №1. Получают 0,15 кг продукта, содержащего 91% пептидов и 8% аминокислот.

28 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН — форме, объем анионита 1,6 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 28,5 л раствора с pH 2,3. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3%>аммиаком. Получают 2,9 л элюата (pH 10,1), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационной сушилке. Получают 0,33 г продукта, содержащего 90% пептидов и 7% аминокислот.

Продукт «Поликардин», полученный по примеру №2, использовали для изучения биологической активности при экспериментальном инфаркте миокарда. Моделирование инфаркта миокарда проводили перевязкой левой коронарной артерии крыс. Препаратом сравнения служил стандартный лекарственный препарат — антигипоксант «Ренитек». Препараты вводили интрагастрально 1 раз в сутки курсом 5 дней до экспериментального инфаркта миокарда и курсом 7 дней после, в виде водных растворов, Ренитек в дозе 1 мг/кг. Поликардин в дозе 100 мг/кг. Обнаружено, что БАД «Поликардин» достоверно обладает противоишемическим действием, сопоставимым с таковым у препарата «Ренитек», препятствует формированию очага некроза и достоверно повышает выживаемость экспериментальных животных в условиях острой гипоксии.

Способ получения пептидов, включающий автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием, очистку автолизата на ионитах и получение водного раствора пептидов, при этом в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола, отличающийся тем, что полученный водный раствор пептидов пропускают последовательно через гелевый анионит до получения раствора с pH 2,0-2,6, а затем через гелевый катионит с содержанием дивинилбензола 1-2% или макропористый катионит.

www.findpatent.ru

Биологически активный пептид и иммуномодулирующая и противовирусная фармацевтическая композиция

Владельцы патента RU 2575069:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к синтетическим пептидам с иммуностимулирующими свойствами, и может быть использовано в медицине. Синтезирован ряд пептидов, отличающихся по химической структуре от известных биологически активных пептидов Аллоферонов и Аллостатинов. Отличие состоит в том, что в положении 6 структуры His-Gly-Val-Ser-Gly-Х-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly вместо гистидина или триптофана, характерных для этих пептидов, находятся другие аминокислоты алифатического и ароматического рядов, а также их химические модификации. Полученные пептиды используются в составе иммуномодулирующей и противовирусной фармацевтической композиции. Изобретение позволяет получить пептиды, эффективно индуцирующие выработку интерлейкина-18 и интерферона гамма. 2 н.п. ф-лы, 4 табл., 4 пр.

Изобретение относится к белкам и биологически активным пептидам с иммуномодулирующей и противовирусной активностью.

Известна биологическая активность низкомолекулярных пептидов. Описан ряд пептидов, которые обладают прямым противовирусным или противоопухолевым действием [Акияма Н., Хиджиката М., Кобаяси А., Ямори Т., Цуруо Т., Натори С. Противораковое воздействие N-β-аланил-5-S-глютатионил диоксифенилаланина (5-S-GAD), новое антибактериальное вещество, получаемое из насекомых. Противораковое исследование, 2000, Т. 20, стр. 357-362].

Особое место в этом ряду занимают пептиды земноводных и насекомых [Булет П., Хетру К., Диамарк Дж., Хоффман Д. Противомикробные пептиды в насекомых: структура и функция. Разв. Срав. Иммунол., 1999. Т. 23, стр. 329-344, Чинчар В.Г., Ванг Дж., Мурти Г., Кейри К., Роллинг-Смит Л. Инактивация вируса 3 лягушек и вируса проточного сома ескулентином-2Р и ранатуерином-2Р, двумя противомикробными пептидами, выделенными из кожи лягушек. Вирология, 2001. Т. 288, стр. 351-357].

Известна группа противовирусных пептидов, выделенных из насекомых с общим названием Аллофероны, описываемая общей формулой: X1-His-Gly-X2-His-Gly-Val-X3 или их фармацевтически приемлемые соли, где X1 отсутствует либо содержит не менее 1 аминокислоты, Х2 содержит не менее 1 аминокислоты либо представляет собой пептидную связь; Х3 отсутствует либо содержит не менее 1 аминокислоты, причем указанные аминокислоты выбраны из групп: алифатической, ароматической или гетероциклической. (Патент РФ №2172322, МПК С07К 7/06, С07К 7/08, А61К 38/08, А61К 38/10, А61Р 37/02, опубл. 20.08.2001 г.).

На основе пептида Аллоферона-1 разработано и производится лекарственное средство «Аллокин-альфа» — лиофилизат для подкожных инъекций, применяемое при лечении герпеса, острого гепатита В и папилломовирусных инфекций.

Близкой к Аллоферонам по строению и свойствам является группа пептидов под общим названием Аллостатины с общей формулой: X1-Trp-Gly-Gln-X2 (Патент РФ №2267496, МПК С07К 7/06, А61К 38/08, А61К 38/10, опубл. 10.01.2006).

Аллостатин-1, отличающийся от Аллоферона-1 наличием двух остатков триптофана (Trp), замещающих гистидин (His) и валин (Val), обладает не только высокой противовирусной активностью, но и противоопухолевым действием.

Данный пример показывает, что замена аминокислотных остатков в молекулах указанных пептидах может существенно изменить их биологические свойства.

Аллофероны являются наиболее близкими аналогами предлагаемого изобретения по химической структуре и механизму действия.

Кроме того, ранее методом компьютерного моделирования пространственной структуры молекулы Аллоферона-1 была показана важнейшая роль остатков гистидина в конформации молекулы пептида. Причем наиболее важный вклад вносят остатки гистидина, находящиеся в положениях 6 и 9. (Патент РФ №2470031, МПК С07К 7/06 А61К 38/08, А61К 38/10, опубл. 20.12.2012).

Наличие других аминокислот в этих положениях существенно изменяет конформацию молекул и, соответственно, их биологическую активность.

Технической задачей, на решение которой направлено заявляемой изобретение, является создание новых пептидов, обладающих повышенной биологической активностью, которые могут быть использованы для создания лекарственных препаратов для лечения и профилактики вирусных и микробных инфекций.

Поставленная техническая задача решена тем, что синтезирован биологически активный пептид:

His-Gly-Val-Ser-Gly-Tyr-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид I), или

His-Gly-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид II), или

His-Gly-Val-Ser-Gly-Arg-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид III), или

His-Gly-Val-Ser-Gly-Lys-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид IV), или

His-Gly-Val-Ser-Gly-Phe-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид V), или

His-Gly-Val-Ser-Gly-Phe(p-OMet)-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид VI), или

His-Gly-Val-Ser-Gly-Phe(p-Cl)-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид VII),

обладающий повышенной индукцией гамма-интерферона и интерлейкина-18.

Поставленная техническая задача решена также тем, что получена иммуномодулирующая и противовирусная фармацевтическая композиция, содержащая один или несколько пептидов, приведенных выше, или их фармацевтически приемлемых солей в эффективном количестве в сочетании со стандартными вспомогательными веществами.

Синтезированные пептиды отличаются наличием различных аминокислот алифатического и ароматического рядов в положении 6. Для данных пептидов определена биологическая активность синтезированных пептидов.

Технический результат состоит в получении пептидов с повышенной индукцией гамма-интерферона и интерлейкина-18 по сравнению с Аллофероном-1, что обуславливает повышенную иммуномодулирующую и противовирусную активность, что будет подтверждено примерами.

Следует отметить, что сходство химической структуры полученных пептидов I-VII с Аллофероном-1 и Аллостатином-1 является чисто внешним. Они не укладываются в формулы этих групп пептидов.

Синтез пептидов произведен по стандартной Fmoc-процедуре твердофазным способом. Удаление защиты производилось 20%-м раствором пиперидина в диметилформамиде. Реакцию сочетания проводили с помощью HBTU в присутствии HOBt и NMM в течение 2 часов при комнатной температуре. Финишное отделение пептидов проводили с помощью TFA, EDT и воды (95:2,5:2,5) в течение 2 часов при комнатной температуре.

Сырые пептиды промывались холодным диэтиловым эфиром, растворялись в воде и лиофилизовались. Очистка пептидов производилась методом HPLC с использованием колонок TOSOH Bioscience С18 (21,5 мм × 300 мм) (Tosoh, Japan) с UV-детектором 210/240 нм. Процесс проводили в градиенте вода — ацетонитрил, содержащий 0,1% TFA при скорости потока 7 мл/мин. Очищенные лиофилизованные пептиды имели чистоту более 95%.

Финишная стадия получения пептидов — лиофилизация из раствора в 50% уксусной кислоте.

Химическая идентификация пептидов была подтверждена методом масс-спектрометрии с использованием масс-спектрометра типа Microflex LT MALDI-TOF (Bruker Daltonics GmbH).

Возможность достижения цели изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Изучение влияния биологически активных пептидов I-VII на индукцию IL-18

Индукция осуществлялась путем введения подкожно Аллоферона-1 и биологически активных пептидов I-VII однократно в дозе 2 мг на кг веса лабораторных животных. Для эксперимента использовались мыши линии BALB/C, самки, массой 16-22 грамма, возраста 14 недель, полученные из питомника лабораторных животных и прошедшие необходимый карантин. Температура окружающей среды была 22±2°C, относительная влажность 60±5%, содержание аммиака составляло 10 ррм, углекислого газа — не превышало 0,15% к объему воздуха, кратность воздухообмена составляла 10-15 крат/час при скорости движения воздуха — 0,3 м/с. Фильтрование воздуха обеспечивали с помощью фильтров грубой фильтрации. Кормили мышей гранулированным комбикормом, изготовленным в соответствии со стандартами приготовления кормов для лабораторных животных. Корм предварительно стерилизовали в автоклаве с использованием вакуума при 121°C и 1,2 атм в течение 20 мин. Кормление проводили 1 раз в сутки из расчета 8,0 г на одну мышь, после чистки клеток. Питьевую воду заливали в бутылки-поилки вместимостью 200 мл и стерилизовали при 121 С и 1,2 атм в течение 45 мин, пробки автоклавировали отдельно. Поилки ежедневно заменяли на новые. Определялся уровень интерлейкина-18 (IL-18) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, с использованием специфических антител. Количество IL-18 в сыворотке определяли на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 16, 24, 32, 40, 48, 56 час после введения препаратов.

Параллельно изучалось «фоновое» количество IL-18, присутствующее в сыворотке крови исследуемых животных. Для этой цели использовалось 14 мышей в качестве контрольной группы, которые получали подкожную инъекцию физиологического раствора. В опытной группе использовалось 336 животных. В случае контрольной группы доверительный интервал рассчитывался по измерениям разведения одного и того же образца. В опытной группе доверительный интервал вычислялся относительно трех образцов от трех животных на каждую измеряемую точку.

Через 3-4 часа после введения у всех пептидов наблюдается небольшой достоверный пик увеличения концентрации IL-18. Через 24 часа наблюдается второй пик значительного увеличения содержания IL-18 в сыворотке крови опытной группы животных, который длится около 20 часов. Наличие первого пика на 3-4 часу возможно обусловлено не специфической индукцией. Значительное повышение IL-18 на 2-3-й день эксперимента свидетельствует о специфической способности препаратов индуцировать изучаемый цитокин.

Результаты испытания препарата приведены в таблице 1.

Введение как Аллоферона-1, так и пептидов I-VII, вызвало индукцию ИЛ-18, которая длилась до 3 суток. Максимальная концентрация ИЛ-18 достигается спустя 30 часов после однократного введения пептидов. Характер индукции — интенсивность и временной диапазон — для пептидов одинаков.

Для всех изученных пептидов зафиксирована индукция интерлейкина-18, уровень которой превышает величину, достигаемую Аллофероном-1. Максимальный уровень интерлейкина-18 через 32 часа (410 пг/мл) был зафиксирован для пептида I. Фоновый уровень в среднем в группе контрольных животных составил 200 пг на мл.

Пример 2. Изучение интерфероногенной активности изучаемых пептидов I-VII

Активность определялась путем введения подкожно изучаемых пептидов однократно в дозе 1 мг на кг веса лабораторных животных. Для эксперимента использовались мыши линии BALB/C, самки, массой 16-22 грамма, возраста 18 недель, содержавшиеся в соответствии с протоколом, изложенным выше в примере 1. Определялся уровень интерферона гамма в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, с использованием специфических антител. Количество интерферона в сыворотке определяли на 3, 6, 12, 16, 24, 32, 40 и 48 час после введения препарата.

Параллельно изучалось «фоновое» количество интерферона гамма, присутствующее в сыворотке исследуемых животных. Для этой цели использовалось 8 мышей в качестве контрольной группы, которые получали подкожную инъекцию физиологического раствора. Среднее значение по контрольной группе на 5% уровне значимости составило 29±8 пг/мл исследуемой сыворотки. В каждой опытной группе также использовались по 8 мышей, которые получали подкожную инъекцию препаратов в дозе 25 мкг с изучаемыми пептидами I-VII, а также Аллофероном-1. Результаты испытания препаратов представлены в таблице 2.

Полученные данные свидетельствуют о том, что изучаемые пептиды I-VII вызывают индукцию интерферона гамма, превышающую уровень индукции Аллоферона-1.

Пример 3. Изучение влияния биологически активных пептидов I-VII на резистентность мышей к вирусу гриппа А

Антивирусное действие биологически активных пептидов I-VII изучали на модели летальной вирусной инфекции мышей вирусом гриппа А. Суспензию вируса вводили интраназально в дозе, соответствующей 10 LD50. Аллоферон-1 и пептиды I-VII в 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида вводили внутрибрюшинно за одни сутки до инокуляции вируса, затем через 1, 2, 4, 6 и 8 дней после инокуляции. Препараты испытывали в дозе 25 мкг. В контроле мышам вводили равный объем растворителя. Критерием эффективности служила выживаемость животных через 10 суток после инфицирования вирусом. Для проведения эксперимента были отобраны половозрелые белые мыши, самцы, весом 20,0-22,0 г, полученные из питомника лабораторных животных и прошедшие необходимый карантин. Содержание мышей осуществлялось по протоколу, изложенному выше в примере 1. В эксперименте были использованы 180 мышей.

Введение Аллоферона-1 и биологически активных пептидов I-VII инфицированным животным вызывало дозозависимый протекторный эффект (Таблица 3). Препараты в дозе 25 мкг вызывали значительное увеличение числа выживших в течение срока наблюдения животных. Эффект данной дозы высокодостоверен.

Таким образом, результаты примера 3 свидетельствуют о том, что биологически активные пептиды I-VII в дозе 25 мкг оказывают выраженное антивирусное действие на мышей, инфицированных вирусом гриппа А, превышающее антивирусное действие Аллоферона-1.

Пример 4. Изучение влияния биологически активных пептидов I-VII на резистентность мышей к вирусу гриппа В

Исследование влияния биологически активных пептидов I-VII на устойчивость мышей к вирусу гриппа В проводилось на 200 мышах. Для проведения эксперимента были отобраны половозрелые белые мыши, самцы, весом 20,0-22,0 г, полученные из питомника лабораторных животных и прошедшие необходимый карантин. Содержание мышей осуществлялось по протоколу, изложенному выше в примере 1. Мышей инфицировали штаммом LEE 1/40 вируса гриппа В, взятым в инфекционной дозе, соответствующих 30 ЛД50. В качестве позитивного контроля использовали специфический антивирусный препарат Рибавирин.

Аллоферон-1 и биологически активные пептиды I-VII вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мкг за 1 сутки до инфицирования вирусом, затем через 1, 2, 4, 6 и 8 суток.

Результаты изложены в Таблице 4.

В контроле интраназальное введение вируса вызвало тяжелую пневмонию с высокой летальностью (80%). На этом фоне Рибавирин при высокой инфекционной нагрузке (30 ЛД50) в условиях данного эксперимента оказался малоэффективным. В то же время биологически активные пептиды I-VII оказали выраженное протекторное действие, превышающее антивирусное действие Аллоферона-1.

Таким образом, результаты примера 4 свидетельствуют о том, что биологически активные пептиды I-VII в дозе 25 мкг оказывают выраженное антивирусное действие на мышей, инфицированных вирусом гриппа В, существенно превышающие защитный эффект как Рибавирина, хорошо зарекомендовавшего себя антивирусного средства, а также Аллоферона-1, и могут служить основой для создания новых антивирусных препаратов.

1. Биологически активный пептид
His-Gly-Val-Ser-Gly-Tyr-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, или
His-Gly-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, или
His-Gly-Val-Ser-Gly-Arg-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, или
His-Gly-Val-Ser-Gly-Lys-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, или
His-Gly-Val-Ser-Gly-Phe-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, или
His-Gly-Val-Ser-Gly-Phe(p-OMet)-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, или
His-Gly-Val-Ser-Gly-Phe(p-Cl)-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly,
обладающий повышенной индукцией гамма-интерферона и интерлейкина-18.

2. Иммуномодулирующая и противовирусная фармацевтическая композиция, содержащая один или несколько пептидов по п. 1 или их фармацевтически приемлемых солей в эффективном количестве в сочетании со стандартными вспомогательными веществами.

www.findpatent.ru

Еще по теме:

  • Приказ о допуске к экзаменам Приказ о допуске к экзаменам МУНИЦИПАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ 1 – ПЕТРОПАВЛОВСКАЯ СРЕДНЯЯ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ШКОЛА От 24 .05. 2008 № 33 О допуске к государственной (итоговой) аттестации учащихся 9 класса, освоивших образовательные […]
  • Закон о воинской службе ссср Закон СССР от 28 марта 1990 г. N 1395-I "О внесении изменений в Закон СССР "О всеобщей воинской обязанности" (прекратил действие) Закон СССР от 28 марта 1990 г. N 1395-I"О внесении изменений в Закон СССР "О всеобщей воинской обязанности" Настоящий […]
  • Красноперекопский суды г ярославля Красноперекопский суды г ярославля Главной задачей Судебной системы является защита гарантированных Конституцией Российской Федерации прав и свобод граждан. Наш сайт призван обеспечить доступность и открытость судебной системы в условиях […]
  • Что нужно выдать работнику при увольнении Справки при увольнении Актуально на: 11 января 2018 г. Главный документ, который работодатель обязательно должен выдать работнику в день увольнения, это его трудовая книжка. Но кроме того по письменному запросу работника работодатель обязан […]
  • Собственность имущество капитал Эксперты советуют отказаться от практики дарения долей в праве на имущество, приобретенное за счет средств материнского капитала Согласно действующему законодательству жилое помещение, приобретенное, построенное или реконструированное с […]
  • Приказ о формах бухгалтерской отчетности организации 2014 Приказ Министерства финансов Российской Федерации (Минфин России) от 17 августа 2012 г. N 113н г. Москва "О внесении изменений в приказ Министерства финансов Российской Федерации от 2 июля 2010 г. N 66н" Зарегистрирован в Минюсте РФ 4 октября 2012 […]